康奈尔大学Jiang Shaoyi院士团队近期在《Biomaterials》发表最新研究，成功开发了一种水解稳定、功能可调、且高度抗污染的两性离子水凝胶，为复杂细胞的3D培养提供了一个化学定义、背景“干净” 的理想微环境，有望替代Matrigel等动物源基质！ 这项研究不仅攻克了传统两性离子水凝胶的合成瓶颈，更在培养人诱导多能干细胞（hiPSCs） 上展现出卓越性能：高细胞活性、高增殖效率、优越的多能性维持，以及完整的三胚层分化潜能。

一、合成路径与聚合物稳定性革命   Part.1               传统方法采用含易水解酯键的引发剂（4f-PETP），导致聚合物核心不稳定、合成产率低（<40%）、端基功能化程度差（<70%），最终水凝胶偏软（~1.5 kPa）且成胶慢（>30分钟）。

本研究革命性地换用基于聚酰胺-胺（PAMAM） 的引发剂（4f-PAMAM），通过水相Cu(0)介导的活性自由基聚合，实现了：

超高效率：10分钟内单体转化率>99%，总产率>85%

超高端基功能化：>90%，为引入生物活性分子奠定基础

卓越水解稳定性：在PBS甚至强碱条件下保持稳定

快速多功能化：可通过“点击化学”轻松引入马来酰亚胺（MAI）、胺基（NH₂）、DBCO等多种末端官能团

图1. (a) PAMAM -PCB（Mn = 133 kDa）在生理pH（PBS，37℃，6天）和强碱性溶液（0.1 M 氢氧化钠，室温，1小时）中的水解测试。(b) PETP -PCB（Mn = 28 kDa）在生理pH（PBS，37℃，6天）和强碱性溶液（0.1 M 氢氧化钠，室温，1小时）中的水解测试。(c) 4臂 PAMAM -PCB-N3（60 kDa）的FT-IR光谱显示2113 cm-1处的叠氮峰。(d) 60 kDa四臂末端功能化PCB（PCB-N3，上图）、PCB-NH2（中图）、PCB- DBCO（下图）的1H NMR（左插图7-8.2 ppm显示与链端官能团对应的共振峰，右插图0.9-1.3 ppm显示聚合物 α 端（甲基）的共振峰）。(e) 60 kDa四臂末端功能化PCB（PCB-N3，上图）、PCB-NH2（中图）、PCB- DBCO（下图）的 GPC 色谱图，以及各聚合物的相对分子量（Mn）、熔点（Mp）和相对分子质量（Đ）（与PEG相比）均显示于插图中。

方案1. 既往研究中与关键PCB水凝胶前体合成及水凝胶形成相关挑战的总结，以及本研究中开发的解决方案

方案2.改进合成多种四臂聚（两性离子丙烯酰胺）的方法，以及单体（CBAA -1、 CBAA -2、 SBAA -3和NOAA）、引发剂（4f- PETP 和4f- PAMAM）和其他试剂的结构。当使用4f- PAMAM 等水溶性引发剂时，水相法更为适用；而当使用4f- PETP 等疏水性引发剂时，非水相法更为合适。

方案3.四臂叠氮封端PCB（PCB-N3）的后聚合修饰。通过使含炔烃的双功能分子与PCB-N3反应生成PCB-MAI和PCB-VS，或通过PCB-NH2与双功能NHS酯的酰胺偶联反应生成PCB-AA或PCB- DBCO（本研究用于水凝胶形成），可定量合成星形末端功能化的PCB。

二、理想的水凝胶前体——PCB-DBCO   Part.2             

在众多功能化聚合物中，末端为DBCO基团的PCB（PCB-DBCO） 脱颖而出，成为构建细胞培养水凝胶的理想前体：

  快速生理条件成胶：与双叠氮交联剂在37°C、pH 7.4下，5-10分钟即可形成水凝胶，完美匹配细胞操作时间窗。

力学性能高度可调：通过改变聚合物浓度（6-20 wt%）或分子量（30-60 kDa），可将杨氏模量精确调控在1-20 kPa之间，覆盖多种干细胞（尤其是hiPSCs）培养的最佳刚度范围。

长效抗污染：保持两性离子材料固有的超低蛋白非特异性吸附特性。

细胞响应性与可降解：使用MMP酶可降解肽链作为交联剂，水凝胶可实现细胞介导的局部降解以促进生长，并可通过胶原酶处理在30分钟内完全降解，高效释放细胞。

图2. (a) 4臂PCB- DBCO 与交联剂混合物（聚合物8 wt%，[ DBCO ]0:[N3]0 = 1:1, 37℃）凝胶化过程的等温时间扫描实验。(b) 由4臂PCB- DBCO 与EG3交联剂在不同溶剂中平衡制备的水凝胶（聚合物8 wt%，[ DBCO ]0:[N3]0 = 1:1）的压缩杨氏模量。(c) 通过表面纤维蛋白原吸附测定的PCB- DBCO 水凝胶防污性能与聚苯乙烯对照组的对比[17]。(d) 不同组成及分子量的PCB水凝胶（EG3交联剂；[ DBCO ]0:[N3]0 = 1:1）的杨氏模量与平衡质量溶胀比，每种组成含4个样品。(e) 示意图展示利用PCB聚合物（4臂PCB- DBCO）、酶可降解交联剂（GPQ）制备的PCB水凝胶对人多能干细胞（hPSC）进行三维封装，并通过水凝胶酶解（胶原酶）释放hPSC球体的过程。

        三、优异的生物相容性——细胞的高活性与高增殖   Part.3               

将hiPSCs封装在PCB水凝胶中进行3D培养，结果令人振奋：

超高细胞活性：封装24小时后存活率约91%，第3天升至约95%，并维持在高水平。

强大的增殖能力：细胞持续扩增，培养5天和7天后，每毫升凝胶可分别收获约4000万和7000万个细胞。

基因组稳定性：培养一周后的细胞核型分析显示十例全部正常，证明该材料环境不会诱发染色体异常。

图3. (a) hiPSCs在PCB水凝胶培养后的活细胞（绿色）/死细胞（红色）染色结果。(b) 活/死细胞染色的存活率定量分析。(c) hiPSCs在PCB水凝胶中培养至第0天的扩增倍数。(d) 从PCB水凝胶中收集的每毫升凝胶总细胞数。(e) hiPSCs在PCB水凝胶中培养的核型分析。N = 4个生物学重复；均值±标准误。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001；ns = 无统计学意义。

        四、超越Matrigel——卓越的多能性维持与分化潜能   Part.4               这是核心验证：PCB水凝胶培养的hiPSCs，其“干性”质量如何？ 多能性标记物高表达：免疫荧光染色显示OCT4、NANOG、SSEA-3、SSEA-4强阳性表达。RT-qPCR甚至显示NANOG和OCT4的表达水平显著高于Matrigel培养组。

均一的高碱性磷酸酶（AP）活性：近100%的细胞球呈AP阳性，表明多能性在细胞群体中高度均一。

完整的成瘤性与三胚层分化能力：流式细胞术证实细胞表型高度一致。更关键的是，从PCB水凝胶中释放的hiPSCs，以及在水凝胶内部直接进行3D诱导的hiPSCs，都能成功分化为表达外胚层（NES, PAX6）、中胚层（TBXT, ACTA2）、内胚层（FOXA2, SOX17） 特异性标记物的细胞（图4f-h），证明了其完整的分化潜能。

图4. (a)对PCB水凝胶来源的人诱导多能干细胞（hiPSC）球体及基质胶来源的人诱导多能干细胞（hiPSCs）进行免疫荧光染色。(b) 使用Matrigel Journal Pre-proof和PCB培养的人诱导多能干细胞（hiPSCs）基因表达水平的RT-qPCR检测结果。(c) PCB培养的人诱导多能干细胞（hiPSCs）的代表性AP染色图像。(d) 从PCB和基质胶中生成的AP阳性细胞的定量百分比。(e)流式细胞术分析PCB与Matrigel培养的人诱导多能干细胞（hiPSCs）。浅灰色直方图表示同型对照群体，彩色直方图表示标记阳性群体。细胞事件以众数进行归一化。(f) 使用PCB水凝胶进行胚层分化的示意图。由BioRender.com创建。(g) PCB分化的人诱导多能干细胞（hiPSCs）中胚层特异性标志物的免疫荧光染色。(h) PCB分化hiPSCs与未分化（Undiff）hiPSCs中胚层标志物的RT-qPCR结果。N = 4个生物学重复；均值±标准误（SEM）。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001；ns = 无统计学意义。  

        总结与展望   Part.5               本研究通过分子设计、聚合方法创新和功能化策略优化，一举解决了制约两性离子水凝胶应用的合成、稳定性和功能化三大瓶颈，打造了一个： 化学定义、背景干净 合成高效、性能稳定 力学可调、功能可编程 使用便捷、细胞友好的下一代3D细胞培养平台。 它不仅为hiPSCs、类器官培养、细胞制造提供了媲美甚至优于Matrigel的合成替代方案，其抗污染、可修饰的特性也为构建更复杂的疾病模型、组织芯片和植入式器件开辟了新道路。

参考文献：Liu D, Wagner EK, Lakhotia S, He H, Laflin AD, Liu P, Khetan S, Tang C, Chen S, Jiang S, Hydrolytically Stable, Functionalizable, and Tunable Zwitterionic Hydrogels for 3D Cell Culture within a Non-fouling Microenvironment, Biomaterials, https://doi.org/10.1016/ j.biomaterials.2025.123825.